Practico 1: reconocimiento de proteinas

PRÁCTICO 1: Reconocimiento de proteínas

1) Reconocimiento de proteínas

El objetivo de la práctica es el reconocer, a través de ensayos experimentales (ensayo de Biuret y Xantoprotéico), la existencia de proteínas en distintas muestras. Las muestras utilizadas son: leche, gelatina, clara de huevo y aspartamo.

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2) Materiales

Vaso de Bohemia                     Leche descremada en polvo

Varilla de vidrio                         Gelatina

Mechero                                   Clara de huevo

Soporte                                     Edulcorante

Tela metálica                            Ácido etanoico 2.0M

Gradilla                                     NaOH al 10%

 Tubo de ensayo                       CuSO4 al 1%

 Termómetro                             Ácido nítrico concentrado

Papel de filtro

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3) Fundamento

Las proteínas dentro de las biomoléculas desempeñan un papel de suma importancia. Las mismas catalizan reacciones químicas (las enzimas), regulan actividad celular (hormonas), entre otras cosas. Es así que el estudio de las mismas, y el entendimiento de cómo se comportan, es necesario para lograr una mejora en la calidad de la amplia cantidad de: actividades, rutinas, procedimientos, etc en los cuales debemos emplearlas, para fomentar una mejor utilización de las mismas. Para lograr comprender una proteína, es necesario primero lograr reconocer cuando estamos en contacto con una sustancia que presenta proteínas. Para ello, se realizan los ensayos de Biuret y Xantoproteico (entre otros) los cuales nos permiten el saber si están presentes o no.

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4) Ensayo de Biuret

La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptídico (- CO- NH -) que se destruye al liberarse los aminoácidos. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret. Debido a dicha reacción fue que observamos que al agregar el reactivo de sulfato de cobre mas solución de proteína precipito una coloración violeta (en los casos positivos).

La solución que reaccionará con la muestra, es una solución de hidróxido de potasio (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6·4H2O). Esta solución presenta una coloración azul, que en caso de que, al reaccionar con la muestra, dando un color violáceo, significará que es positivo, y por lo tanto existen enlaces peptídicos y por lo tanto péptidos y/o proteínas.  El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción (es un ión expectador), pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.

La reacción que se da entre la muestra y el biuret, consiste en que, al hacer reaccionar una proteína o péptido con Cu2+ en medio alcalino se forma  un complejo de coordinación entre el Cu2+ y los pares de electrones libres de los N de los grupos amino de la unión peptídica. Son necesarias por lo menos dos uniones peptídicas para que tenga lugar la reacción, y por esa razón no reacciona formando el color violeta en presencia de aminoácidos.

La reacción del biuret no se aplica únicamente a proteínas, debido a esto, el resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado, y tener una noción de los componentes de la solución (los cuales podrían llegar a reaccionar con el ión complejo)  para descartar los resultados falsos positivos, ya que si los mismos reaccionan con el ión complejo, el biuret tendría una coloración violeta, lo cual significaría que es positivo. Sin embargo, debido a que lo que reaccionaron no fueron necesariamente proteínas, podría no haber, e igualmente ser positivo, de ahí que existen los falsos positivos.

Al igual que existen falsos positivos, existen falsos negativo, lo cual significa que, diversos factores de la experiencia, llevan a una alteración en el ión complejo, el hidróxido de potasio o las proteínas de la muestra. Las razones mas comunes, por las cuales suelen haber falsos negativos son:

a) Que existan una o más sustancias interferentes en la muestra que impidan que se produzca la reacción. Esto puede descartarse (o evitarse) si se tiene un conocimiento aproximado de la composición de la muestra.

b) El medio en el cual reacciona el biuret, es un medio alcalino (por esa razón se hace en presencia de una base fuerte como lo es el KOH), ya que el mismo es necesario para la formación del complejo Cu2+,.debido a esto se debe tomar especial precaución en el medio en el cual se da el biuret. En caso de que esta reacción ocurra, o se intente que esta reacción ocurra en medio ácido, los H+ del medio interferirán con la reacción del biuret. En este caso la interferencia puede eliminarse alcalinizando el medio antes de realizar el ensayo.

c) Que existan péptidos, pero a una concentración inferior al límite de sensibilidad del método. Todo método permite determinar la presencia de un compuesto sólo si la concentración del mismo es superior a cierto valor. Existen métodos mucho más sensibles que el biuret.

5) Ensayo Xantoprotéico

Esta reacción se usa para detectar la presencia de proteínas solubles en una solución. Se realiza mediante el uso de HNO3 concentrado que, en presencia de proteínas o aminoácidos con restos aromáticos torna la solución de un color amarillo oscuro. 

Los anillos fenilo que contengan un grupo activante pueden ser nitrados produciendo un compuesto Amarillo. La producción de un producto coloreado Amarillo al añadir ácido nítrico es una prueba para la presencia de tirosina o triptófano en una proteína. La adición de base fuerte hace que el color se torne más oscuro hacia anaranjado. Las manchas amarillas en la piel causadas por ácido nítrico son el resultado de la reacción xantoproteíca.

La reacción xantoproteica se puede considerar como una sustitución electrofilica aromática de los residuos de tirosina de las proteínas por el ácido nítrico dando un compuesto coloreado amarillo a pH ácido.

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Ensayos con las muestras utilizadas:

1) Leche

 La leche es: 

a) Una emulsión de materia grasa (principalmente triacilglicéridos) en un medio acuoso.

b) una suspensión de materia proteica (caseína, albumina, globulina) en un medio acuoso.

c) una solución acuosa de sales minerales y lactosa.

Contiene además menores de lecitina, vitaminas, enzimas, nuclétidos, y gases disueltos. La composición es variable según la especie considerada.

Dentro de los componentes proteicos encontramos:

1) Caseína: complejo de proteínas fosforadas. Constituye el 80% del total de los compuestos nitrogenados.

2) Proteínas de lactosuero: albuminas y globulinas. Se insolubilizan por acción del calor antes de los 100 ºC

3) Proteosas- peptonas: Glicoproteínas poco abundantes en la leche.

Caseína:

Es una proteína de carácter ácido debido a su elevada proporción de aminoácidos ácidos (PI=4,6).

La caseína humana es más rica en cistina y glúcidos que la vaca, lo que la hace más apropiada para el bebé.

Reacciona con las bases formando caseinatos utilizados en la industria para la fabricación de colas y adhesivos. También se utiliza en la industria textil.

La caseína precipita por acción de los ácidos. Esto puede ocurrir a través de las formulación de ácido láctico por la acción bacteriana sobre la lactosa o mediante el agregado de un ácido hasta alcanzar el pH correspondiente a su punto isoeléctrico. La precipitación puede producirse por la acción enzimática de la quimiotripsina.

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 Estructura de una miscela de Caseína

PROCEDIMIENTO

1) Coloque aproximadamente 25 ml de leche descremada en un vaso de Bohemia

2) Caliente hasta aproximadamente 40ºC agitando con la varilla de vidrio.

3) Adicione ácido etanoico 2,0M (gota a gota) agitando en forma continua hasta coagulación total.

4) Separe el coágulo de caseína del suero mediante floración.

5) Seque cuidadosamente la caseína con la ayuda del papel de filtro.

6) Separe dos porciones del sólido obtenido de aproximadamente 1 cm3 y colóquelas en dos tubos de ensayo.

CARACTERIZACIÓN: 

Reacción de Biuret: Agregue sobre la caseína uno de los tubos 20 gotas de NaOH al 10%. Luego agregue dos gotas de solución de CuSO4 al 1%. Anote sus observaciones.

En la experiencia hemos visto que el tubo de ensayo cambiaba su color de una coloración azulada, a una violácea, lo cual determina que en la caseína, y por lo tanto, la leche, existen enlaces peptídicos.

Reacción Xantoproteica: Agregue sobre la caseína del segundo tubo 10 gotas de HNO3 concentrado. Espere un par de minutos y anote sus observaciones. 

Luego del ensayo xantoproteico, en el tubo de ensayos la muestra presenta un color amarillo, esto demuestra la presencia de tirosina o triptófano en la caseína. 

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2) Gelatina:

La gelatina es una proteína compleja, es decir, un polímero compuesto por aminoácidos. Como sucede con los polisacáridos, el grado de polimerización, la naturaleza de los monómeros y la secuencia en la cadena proteica determinan sus propiedades generales. Una notable propiedad de las disoluciones de esta molécula es su comportamiento frente a temperaturas diferentes: son líquidas en agua caliente y se solidifican en agua fría.

Al ser proteína en estado puro, ésa es su mayor propiedad nutritiva: proteína (84-90%), sales minerales (1-2%) y agua (el resto). La gelatina se utiliza en la fabricación de alimentos para el enriquecimiento proteínico, para la reducción de hidratos de carbono y como sustancia portadora de vitaminas.

ESTRUCTURA DE LA GELATINA (COLÁGENO)

PROCEDIMIENTO:

1) Tomar una muestra de gelatina

2) Colocarla en dos tubos de ensayo

3) Realizar las reacciones ya mencionadas

CARACTERIZACIÓN:

Ensayo de Biuret: Al realizarle un biuret a la muestra, se obtiene una coloración violácea lo cual significa que en la muestra existen enlaces peptídicos.

Ensayo de Xantoprotéico:  Al realizarle este ensayo a la muestra, la misma se mantiene incolora, lo cual significa que en la misma no existen grupos aromáticos fenilo o triptófano.

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3) Clara de huevo

La clara de huevo está compuesta fundamentalmente por agua y ovoalbúmina es así, que al realizar este ensayo, se tomara a la ovoalbúmina como componente fundamental para la realización del ensayo. La ovalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo y la que le da sus propiedades características (junto con la otra albúmina no fosforada).

La ovoalbúmina es, pues, una fosfoglicoproteína. Es una proteína de referencia en bioquímica y es conocida a la industria alimentaria por sus propiedades como transportadora, estabilizadora y formadora de emulsiones.

Posee usos médicos. La ovoalbúmina está relacionada con los metales pesados y su misión es la de atrapar los iones de los metales pesados debido a la presencia de las uniones sulfhídricas de la proteína. Su coagulación tras el proceso de absorción previene la absorción de metales en el tracto gastrointestinal previniendo el envenenamiento.

PROCEDIMIENTO:

1) Romper un huevo

2) Separar la clara de la yema

3) Remover la clara y colocarla en agua

4) Colocar parte de la solución en dos tubos de ensayo

5) Realizar las dos reacciones mencionadas

CARACTERIZACIÓN:

Ensayo de Biuret : Al realizar este ensayo, la muestra se torno de un color violáceo, lo cual significa la existencia de enlace peptídico, y por lo tanto de proteínas.

Ensayo Xantoproteico: Al realizar esta muestra, la misma se torno de un color amarillo, lo cual determina la existencia de grupos aromáticos fenilo o triptófano.

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4) Aspartamo

El aspartamo se comercializa como edulcorante de mesa (Natreen, Canderel o Nutrasweet, por ejemplo). También está incorporado en numerosos productos alimenticios en todo el mundo, entre otros en bebidas, postres y dulces. El aspartamo es un polvo blanco e inodoro, unas 200 veces más dulce que el azúcar, que se obtiene mediante la combinación de fenilalanina y de ácido aspartico.

El aspartamo es estable en estado seco o en los productos congelados. No obstante, cuando se conserva en líquidos a temperaturas por encima de los 30°C, se convierte progresivamente en diketopiperazina, que se descompone en metanol, ácido aspártico y fenilalanina. Estas transformaciones resultan en una pérdida de poder edulcorante. Es por ello que el aspartamo no puede ser utilizado en alimentos cocinados o esterilizados.

PROCEDIMIENTO:

1) Tomar una punta de espátula de edulcorante y colocarla en dos tubos de ensayo.

2) Agregar un poco de agua en cada uno de los tubos.

3) Realizar las reacciones mencionadas anteriormente.

CARACTERIZACION:

Ensayo de Biuret: En este caso la muestra no presento ningún cambio en su coloración, por lo cual podemos determinar, que no existen enlaces peptídicos en la muestra.

Ensayo Xantoprotéico: Al igual que en el Biuret, esta muestra tampoco presenta ningún tipo de variación en su coloración, por lo tanto podemos determinar la inexistencia de grupos aromáticos fenilo o trptófano.

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5) Errores:

Errores imprevistos:

Son errores debidos a causas imprevistas o al azar. Son imposibles de controlar y alteran, ya sea por exceso o por defecto, la medida realizada. Pueden deberse a:

  a) Cambios durante el experimento de las condiciones del entorno. Por ejemplo, debido a corrientes de aire, desnivel en la mesa de trabajo, cambios atmosféricos, etc.

  b) Errores de apreciación. Son debidos a fallos en la toma de la medida, asociados a limitaciones sensoriales del observador, la más común es la estimación “a ojo” que se hace de una cierta fracción de la apreciación de la escala de los instrumentos de medida.

Errores esperables:

Son errores que se repiten constantemente en el transcurso de un experimento y que afectan a los resultados finales siempre en el mismo sentido. Son debidos a diversas causas

 a) Errores de calibración o error de los instrumentos de medida.

 b) Condiciones experimentales no apropiadas. Ocurren cuando se emplean los instrumentos de medida bajo condiciones de trabajo (temperatura, humedad, etc.) diferentes de las recomendadas.

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6) Cuadro de resultados:

Muestras	Biuret	Xantoprotéico
Leche	Positivo	Positivo
Gelatina	Positivo	Negativo
Clara de huevo	Positivo	Positivo
Aspartamo	Negativo	Negativo

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7) Diálisis

FUNDAMENTO:

En bioquímica, la diálisis es el proceso de separar las moléculas en una solución por la diferencia en sus índices de difusión o presión osmótica a través de una membrana semipermeable.
La diálisis es una técnica común de laboratorio, y funciona con el mismo principio que diálisis médica. Típicamente una solución de varios tipos de moléculas es puesta en un bolso semipermeable de diálisis, como por ejemplo, en una membrana de la celulosa con poros, y el bolso es sellado. El bolso de diálisis sellado se coloca en un envase con una solución diferente, o agua pura. Las moléculas lo suficientemente pequeñas como para pasar a través de los poros (a menudo agua, sales y otras moléculas pequeñas, en nuestro caso serán iones Na^­+ y NO₃^-) tienden a moverse hacia adentro o hacia afuera del bolso de diálisis en la dirección de la concentración más baja. Moléculas más grandes (a menudo proteínas, ADN, o polisacáridos, en nuestro caso ovoalbumina) que tiene dimensiones significativamente mayores que el diámetro del poro son retenidas dentro del bolso de diálisis. Una razón común de usar esta técnica puede ser para quitar la sal de una solución de la proteína. La técnica no distinguirá efectivamente entre proteínas.
En nuestra práctica, se realizara una solución donde, dentro del dializador habrá, ovoalbúmina,  Na⁺ y Cl^-,  Esto se obtendrá a partir de:

AgNO3 -------------► Ag⁺ (ac)  +  NO₃^-   (ac)

A su vez    Ag⁺ (ac)   +      Cl^-  (ac)                 

formarán AgCl  (s), que será un precipitado blanco

        

NaCl -----------► Na⁺ (ac)  +  Cl^-  (ac)

Si la diálisis se da de forma correcta, luego de finalizarse, las concentraciones de Na⁺ y Cl^- deberán ser iguales tanto dentro como fuera del dializador, para comprobar esto, se tomaran muestras tanto de fuera como de dentro y se las hará reaccionar con AgNO₃, en caso de ser positivo esto, se formara un precipitado blanco. Mientras que la ovoalbúmina, se mantendrá dentro del dializador (debido al tamaño de la molecula), por lo tanto si realizamos un biuret tanto dentro de la muestra como fuera, dentro del dializador debería ser positivo y fuera, debería ser negativo.

MATERIALES:

Dializador (gomita elástica, botella cortada, papel selofan)
Gelatina en solución
AgNO3 (Nitrato de Plata)
 Vaso de Bohemia
 CuSO4 al 1 %
 NaOH  al 10%

Procedimiento 1:

1) Colocar en dos tubos de ensayos muestra de la solución que se pondrá en el dializador.
2) Aplicarle la reacción de Biuret y AgNO₃
3) Registrar las observaciones

Observaciones:

Como se esperaba, al colocar la muestra dentro de los tubos de ensayo, dio positivo tanto con biuret (la solución se torno a un color violáceo), como con el AgNO_3. (se formo un precipitado blanco en la parte superior)

Procedimiento 2:

1) Colocar dentro de un dializador una solución con proteínas y sales
2) Sumergir en un vaso de Bohemia con agua destilada( sin ningún desecho)
3) Luego de 25 minutos, tomar muestras de ambas partes del dializador.
4) Aplicar los ensayos anteriores .
5) Registrar las observaciones.

Observaciones:

Como se esperaba, al realizar el ensayo con AgNO₃ el mismo fue positivo, se formo el precipitado blanco, y a su vez significa que hubo un movimiento de iones hacia afuera de la membra semipermeable. Mientras que, cuando se hizo el biuret, el mismo dio negativo, no hubo cambio en la coloración del mismo, por lo tanto podemos determinar que no hay enlaces peptídicos, y que por lo tanto no hay proteínas, lo cual significa que las mismas no pudieron salir por la membrana semipermeable, lo cual significa que la diálisis se dio de forma correcta.

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Juan Andrés Picerno 

Oscar Ignacio Nosiglia

Joaquín López